1
ستاد ویژه توسعه فناوری نانو Iran Nanotechnology Innovation Council بستن
  • ستاد ویژه توسعه فناوری نانو

  • بانک اطلاعات شاخص های فناوری نانو

  • سایت جشنواره فناوری نانو

  • سیستم جامع آموزش فناوری نانو

  • شبکه آزمایشگاهی فناوری نانو

  • موسسه خدمات فناوری تا بازار

  • کمیته استانداردسازی فناوری نانو

  • پایگاه اشتغال فناوری نانو

  • کمیته نانو فناوری وزارت بهداشت

  • جشنواره برترین ها

  • مجمع بین المللی اقتصاد نانو

  • اکو نانو

  • پایگاه اطلاع رسانی محصولات فناوری نانو ایران

  • شبکه ایمنی نانو

  • همایش ایمنی در نانو

  • گالری چند رسانه ای نانو

  • تجهیزات فناوری نانو

  • صنعت و بازار

  • باشگاه نانو

داروها و دستگاه های ضدباکتریایی برپایه نانوذرات نقره : سازوکارها، موانع روشهای تولید و راهبردها

افراد مقاله : ‌ مترجم - سیده معصومه قاسمی نژادلیچایی , مترجم - فاطمه احمدپور

موضوع : علم و پژوهش کلمات کلیدی : آنتی بیوتیک - نقره تاریخ مقاله : 1394/09/29 تعداد بازدید : 3436

با وجود پیشرفت های اخیر در زمینه کشف دارو و زیست‌فناوری دارویی، بیماری های عفونی باکتریایی به یکی از بزرگ‌ترین مشکلات بهداشتی در سراسر جهان تبدیل شده است که سالیانه میلیون ها نفر به آن مبتلا می شوند. تقریباً بسیاری از میکروارگانسیم ها به دلیل سهولت جهش ژنتیکی، ذاتاً توانایی مقابله با بسیاری از رویکردهای درمانی را دارند. شرکت های بزرگ دارویی در حال از دست دادن علاقه خود در زمینه توسعه آنتی بیوتیک های جدید و تغییر سرمایه گذاری‌ها و تحقیق و توسعه در زمینه های سود آورتر هستند. برای غلبه بر چنین نگرانی هایی راهکارهایی هوشمندانه مورد نیاز است و بایستی فرآیندهای تولید صنعتی آسان با هزینه پایین و اثربخشی بالا با یکدیگر ترکیب شوند. در این چارچوب راه حل های مبتنی بر فناوری نانو و به‌خصوص نانوذرات نقره، به عنوان عوامل ضد باکتریایی جدید، گزینه مناسبی هستند. نانوذرات نقره بسیاری از ویژگی های ضد باکتریایی/ ضد ویروسی را دارند و روش سنتز آنها مقرون به صرفه است. با این حال، با وجود تأثیر فزاینده بر بازار، هنوز برای برخی مسائل پاسخ مشخصی وجود ندارد. این مسائل شامل سازوکار مولکولی برهم‌کنش باکتری-‌ نانوذره نقره، پارامترهای فیزیکی-شیمیایی سمیت پروکایوت ها، کمبود روش های استاندارد و عدم قطعیت در تعریف راهبردهای کلی در توسعه داروها و دستگاه های ضد باکتریایی هوشمند بر پایه نانوذرات نقره است. در این مقاله مروری، داده های آزمایشگاهی خاصیت ضد باکتریایی نانوذرات نقره مورد تحلیل قرار می گیرد و در ادامه مشکلات و محدودیت های موجود در تکنیک ها و روش های مورد استفاده بررسی می شود. علاوه‌بر این، پس از تحلیل سازوکارهای اصلی، برخی راهکارها‌/‌فرآیندها برای تست ضدباکتریایی ارائه و برخی دستورالعمل ها نیز برای طراحی ضد باکتریایی نانوسیستم ها و دستگاه‌ها براساس نانوذرات نقره پیشنهاد می شود.

 

1-    مقدمه

سازوکارهای تکاملی انسان‌ و همزیستی با باکتری‌ها، هزاران سال مسیر مشترکی داشته است که در نتیجه انتخاب برهم‌کنش میان آن‌ها باعث ایجاد همزیستی متقابل[1] یا همسفرگی[2] شده است. وقتی‌که تغییرات محیطی یا ژنتیکی/فیزیولوژیکی باعث ‌شود که این همزیستی به یک رابطه انگلی[3] تبدیل شود، عفونت در ارگانیسم میزبان رخ می‌دهد. بر این اساس، از سال1800م. باکتری‌ها علت بسیاری از بیماری‌های بشر شناخته شده‌اند. از آن زمان تا کنون، تلاش‌های قابل توجهی، نظیر واکسیناسیون، بهبود شرایط بهداشتی و توسعه آنتی بیوتیک‌ها، برای برطرف کردن این نگرانی جدی صورت گرفته است. داروهای ضدمیکروبی از زمان کشف، جان میلیون‌ها نفر را نجات داده‌اند و درد بسیاری از بیماران مبتلا به عفونت‌های مزمن را التیام بخشیده‌اند. جدول 1، خلاصه‌ای از تاریخچه و مراحل تصویب برخی از ترکیبات ضد باکتریایی مورد تأیید سازمان غذا و دارو را نشان می‌دهد.

اگرچه درگذشته جامعه پزشکی به‌طور خوش‌بینانه از داروهای ضدباکتریایی به عنوان داروهای جادویی نام می‌برد، اما شواهد بعدی محدودیت‌های زیاد این داروها را نشان داد. در واقع، باکتری‌ها در طول زمان، چندین سازوکار مقاوم به آنتی بیوتیک‌ها را نشان می‌دهند و در نتیجه درمان آن‌ها بسیار دشوار است. به عنوان مثال در اوایل سال 1940م. پنی‌سیلین‌ها برای درمان گسترده استافیلوکوس‌آرئوس و عفونت‌های مرتبط با آن معرفی شدند. در سال 1942م. اولین مقاومت پنی‌سیلین به استافیلوکوس‌آرئوس گزارش شد. شکل 1، سیر زمانی مقاومت باکتری‌ها به آنتی بیوتیک‌ها را نشان می‌دهد. همان‌طور که مشخص است چند سال پس از تجاری‌سازی یک ترکیب ضد‌باکتریایی جدید (معمولاً بین یک تا سه سال) مقاومت به آن مشاهده می‌شود.

سالانه بیش از 120 میلیارد دلار از هزینه‌های درمانی جامعه آمریکا مستقیماً صرف مراقبت‌های بهداشتی در درمان بیماری‌های عفونی می‌شود. با این وجود هزینه‌های مرتبط با بیماری، مانند مراقبت طولانی مدت و یا درمان عفونت‌های مزمن، در این تخمین نادیده گرفته شده است. علاوه‌بر این، هزینه‌ درمان عوامل بیماری‌زای مقاوم، سالانه در حدود 5 میلیارد دلار است و به دلیل افزایش چشمگیر سویه‌های باکتریایی مقاوم به آنتی بیوتیک‌ها، این هزینه رو به افزایش است (شکل2، ب). علی‌رغم اینکه، درمان عفونت فرصت مناسبی را برای شرکت‌های سازنده دارو با بازار فروش سالانه در حدود 5/25 میلیارد دلار فراهم کرده است، اما اکثر شرکت‌های دارویی تمایل خود را در تحقیق و توسعه در زمینه آنتی بیوتیک‌ها از دست داده‌اند. زیرا این داروها در مقایسه با داروهای مورد استفاده در درمان بیماری‌های مزمن، که نیازمند درمان طولانی مدت هستند، سودآوری کمتری دارند. توسعه آنتی بیوتیک‌ها بسیار پرهزینه (تقریباً یک میلیارد دلار برای یک داروی جدید در بازار مورد نیاز است) ، زمان‌بر و ریسک‌پذیر (نیاز به سرمایه‌گذاری بیش از ده سال) است، همچنین به دلیل چرخه عمر کوتاه (به علت مقاومت باکتریایی) مورد توجه شرکت‌های دارویی نیست. این عوامل سبب می‌شود که شرکت‌های بزرگ دارویی، سرمایه‌گذاری تحقیقاتی خود را بیشتر در مسیرهای تولیدی صرف کنند. تقریباً70 درصد بزرگ‌ترین شرکت‌های دارویی، بخش تحقیق و توسعه آنتی بیوتیک را از سال 1999م. به حالت تعلیق درآورده‌اند، در حالی که روش‌های درمانی برپایه عوامل ضد میکروبی جدید در حال کاهش است (شکل 2، ج). با در نظر گرفتن این موارد، بسیار واضح است که افزایش باکتری‌های مقاوم به آنتی بیوتیک به همراه کاهش قابل توجه در تأیید عوامل ضد باکتریایی در دهه‌های گذشته نگرانی گسترده‌ای را ایجاد کرده است و عفونت‌های باکتریایی بار دیگر به عنوان یکی از بزرگ‌ترین چالش‌های سلامتی مطرح می‌شوند.

از این‌رو یک راه حل طولانی مدت جدید، که می‌تواند مجموعه‌ای از روش‌های زیستی و ابزارهای در دسترس فناوری نانو باشد، برای کنترل موفق چنین بیماری‌هایی لازم است. در میان عوامل ضد باکتریایی غیر رایج، نانوذرات نقره به دلیل خاصیت ضدمیکروبی قوی و گسترده، گزینه‌ای مناسب برای درمان عوامل بیماری‌زای مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک‌های رایج محسوب می‌شود. اگرچه نقره از دیرباز به عنوان عامل ضدباکتریایی شناخته شده است، اما پیشرفت‌های اخیر در رویکرد بالا به پایین، طراحی چندین نوع نانوذرات نقره با خواص فیزیکی- شیمیایی مختلف و قابل تنظیم (مانند، اندازه، شکل و شیمی سطح) را مقدور ساخته است. این مطلب با حجم زیاد داده‌های موجود مربوط به تولید و استفاده از نانوذرات نقره و کاربرد آن‌ها به عنوان عامل ضدمیکروبی تأیید می‌شود (شکل 3، الف). کاربرد ضد‌میکروبی نانوذرات نقره، 10 درصد موارد تجاری/ تحقیقاتی نانوذرات نقره و نانوکامپوزیت برپایه نقره را به خود اختصاص می‌دهد که موجب تولید گسترده سالیانه حدود 320 تن نانوذره نقره در سال می‌شود.

امروزه در بسیاری از محصولات، مانند؛ پوشاک، فیلترهای آب خانگی، لوازم آرایشی، ضد بارداری و حتی در اسباب بازی‌ها، نانوذرات نقره و نانوکامپوزیت‌های نقره به عنوان عوامل ضد باکتریایی استفاده می‌شوند. علاوه‌بر این، در برخی زمینه‌های زیست پزشکی، مانند دندانپزشکی، دارورسانی، ارتوپدی، مراقبت از چشم، اقلام دارویی و همچنین در جراحی از نانوذرات نقره به عنوان عامل ضد باکتریایی قوی استفاده می‌شود. با این حال، علی‌رغم استفاده گسترده و بی‌رویه از محصولات نانوذرات نقره، هنوز دانش روشن و قطعی از اثرات این نانوذرات بر میکروارگانیسم‌ها وجود ندارد. نکته مهم، عدم وجود سنجش استاندارد نانوذرات و تشریح دقیق سازوکار مولکولی فعالیت آن‌ها است. اخیراً، کارهای مهمی در زمینه جنبه‌های تشریح نشده این موضوع انجام شده است. اکهارت[4] و همکارانش تحلیل گسترده‌ای از دیدگاه شیمیایی در مورد برهم‌کنش نقره در سطح مولکولی و سلولی (با تمرکز بر پیوند با آمینواسیدها، پپتیدها، پروتئین‌ها و دی‌ان‌ای) و همچنین بحث‌های جزیی در مورد زیست سازگاری نقره برای دستگاه‌های پزشکی ارائه نموده‌اند. همچنین کرنوسو[5]ا و همکارانش، حاجی پور[6] و همکارانش در مقاله‌ای مروری به اثرات کشندگی زیستی نقره در شکل‌های مختلف (عمدتاً به عنوان فلز، نمک و نانوذره) پرداخته‌اند، در حالی که لمیر[7] و همکارانش بر سازوکارهای اهداف مولکولی فلزات تمرکز نموده‌اند.

در این مقاله مروری، در ابتدا اثرات کشندگی زیستی نانوذرات نقره براساس اطلاعات موجود تحلیل می‌شود، سپس در مورد چالش‌هایی با در نظر گرفتن سازوکار فعالیت نانونقره، کمبود آزمایشات استاندارد و محدودیت‌ یا موانع موجود در تکنیک‌ها و روش‌های به‌کار رفته بحث خواهد شد. همچنین راهبردهایی برای غلبه بر داده‌های آزمایشگاهی نادرست که بر پایه تفاوت‌های رایج در پژوهش‌ها است، ارائه می‌شود.

 

2-   اثرات ضدباکتریایی نانوذرات نقره

در این بخش، برخی از مطالعات مهم در زمینه ویژگی‌های باکتریایی نانوذرات نقره را مورد بررسی قرار داده و به نقش خصوصیات فیزیکی-شیمیایی (اندازه، شکل و ویژگی‌های سطحی) ، سازوکار فعالیت و دوز آن‌ها توجه می‌کنیم. مطالعه اثرات باکتریایی وابسته به اندازه نانوذرات نقره در محدوده 100-1 نانومتر در برابر باکتری گرم منفی (عمدتاً اشرشیا‌کلی، ویبریو‌کلرا، سالمونلا‌تیفی، سودوموناس آئروژینوزا) به‌وسیله‌ی مورونس[8] و همکارانش انجام شده است. آن‌ها نشان دادند که نانوذرات نقره با غلظت mL-1 gµ 75 صرف نظر از اندازه ذرات، قادر به پیشگیری از رشد همه سویه‌های باکتری است. آن‌ها با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری میدان تاریک حلقوی زاویه زیاد (HADDF-TEM) نشان دادند که نانوذرات نقره در محدوده 1-10 نانومتر در مقایسه با نانوذرات بزرگ‌تر با اتصال به سطح غشای سلول با تمایل بالا، عملکرد غشای سلول را مختل می‌کنند. چنین اثری ناشی از مساحت سطحی بیشتر در نانوذرات کوچک‌تر است. برهم‌کنش غشا-نانوذرات نقره سبب ایجاد حفرات موضعی در غشا شده و با ورود نانوذرات به درون سلول و برهم‌کنش با پروتئین‌های درون سلولی (به خصوص پروتئین‌های غنی از سولفور) و DNA آسیب بیشتری به سلول وارد می‌شود. همچنین نویسندگان دریافته‌اند که یون‌های Ag+ آزاد شده از سطح ذرات نیز با سازوکارهای مشابه (اتصال به پروتئین‌های غشا و حفرات موضعی) باعث افزایش خاصیت ضدباکتریایی نانوذرات می‌شود. اگرچه علت اصلی آسیب به غشا براساس دینامیک برهم‌کنش‌های فیزیکی-شیمیایی و اهداف مولکولی درون سلولی نانوذرات یا یون‌های نقره هنوز مشخص نشده است، اما این داده‌ها نشان می‌دهد که اثرات ضدباکتریایی از هر دو یون و نانوذرات نقره ناشی می‌شود زیرا سازوکار فعالیت آن‌ها مشابه است. اثرات وابسته به اندازه و سازوکارهای فعالیت به‌وسیله‌ی چو و هو[9] نیز مورد بررسی قرار گرفته است. در این پژوهش، نانوذرات نقره با اندازه 21-5 نانومتر تولید شده و ارتباط میان اندازه و تولید گونه‌های اکسیژن واکنش‌پذیر درون سلولی (ROS) و پیشگیری از نیتروفیکاسیون[10] در میکروارگانیسم‌های نیترات‌ساز مورد آزمایش قرار گرفته است. در ابتدا، آزمایشات مهار رشد را با استفاده از نانوذرات نقره، کلرید نقره کلوئیدی، و یون‌های Ag+ انجام دادند و دریافتند که نانوذرات نقره بیشترین اثربخشی را دارند. از سوی دیگر، نانوذرات کوچک‌تر اثر بیشتری را در مقایسه با ذرات بزرگ‌تر دارند. در ادامه، آن‌ها نشان دادند که مقدار تولید و تجمع درون سلولی ROS برای نانوذرات نقره، کلرید نقره کلوئیدی و یون‌های Ag+ با یکدیگر مشابه است و نشان دهنده آن است که غلظت ROS عمدتاً با مقدار نهایی نقره ارتباط دارد. در مرحله سوم، غشا سلولی (توسط تست‌های برپایه فلئورسنس باکتری مرده/زنده) مورد بررسی قرار گرفت، یافته‌های این پژوهش برخلاف سایر پژوهش‌ها نشان داد که نقره با غلظت mg/mL 1 (در انواع مدل‌های آزمایش شده) می‌تواند به غشا سلولی آسیب وارد کند. این مطالعه نشان می‌دهد که سمیت نانوذرات نقره به شدت به مرگ سلولی ناشی از ROS وابسته و دوز نهایی نقره پارامتری مهم برای تشخیص اثرات خاص است. در هرحال همان‌طور که پژوهشگران بیان کردند، تأیید مستقیمی از پیشگیری ناشی از ROS وجود ندارد و واضح نیست که کدام یک از گونه‌های یون نقره یا نانوذرات نقره در تولید ROS مؤثرتر است.

همچنین، این نویسندگان مطالعاتی در زمینه بررسی اثر ضد باکتریایی نانوذرات نقره، کلرید نقره کلوییدی و Ag+، عموماً با ترکیب دو روش تنفس‌سنجی[11] و تست فلورسانس میکرولیتر خودکار[12] انجام دادند. اگرچه در این مورد نانوذرات نقره در مقایسه با سایر اشکال نقره (در غلظت یکسان mg/mL 1) ، مهارکننده قوی‌تر تنفس ارگانیسم‌های نیترات‌ساز اتوتروف[13] است، اما تست طولانی مدت میکرولیتر نشان می‌دهد که یون‌های Ag+ در مقایسه با نانوذرات نقره و کلرید نقره (همه در غلظتmg/mL 5/0) ، مؤثرترین مهارکننده رشد ایشریشیا‌کلی GFP است. چنین اطلاعاتی اختلاف در اثربخشی نانوذرات نقره یا یون‌های Ag+، به عنوان عوامل ضدباکتریایی، را نشان می‌دهد. روشن است که نتایج به روش مورد استفاده برای انجام تست بیولوژیکی بستگی دارد و نیاز به استاندارسازی بیشتر روش‌ها است. این مطلب با کار ساندی[14] و همکارانش بیشتر مورد تأیید قرار گرفت. آن‌ها پیشگیری از رشد E.coli را در مجاورت نانوذرات نقره و در محیط‌های مایع و جامد ارزیابی کردند. یافته‌ها نشان داد که نانوذرات نقره در مایع اثربخشی کمتری در مقایسه با محیط جامد (در غلظت یکسان) دارد. این اختلاف ممکن است با دوز نهایی مؤثر نقره موجود تشریح شود. تصویر TEMو SEM، حفراتی در دیواره سلولی باکتری در مجاورت نانوذرات نقره با اندازه متوسط 25 نانومتر نشان می‌دهد و یافته‌ها آسیب نانوذرات به غشا را تأیید می‌کند.

تأثیر ویژگی‌های فیزیکی-شیمیایی نانوذرات بر آسیب غشا به‌وسیله‌ی ال‌بداوی و همکارانش مورد بررسی قرار گرفت. نویسندگان سمیت نانوذرات نقره را با تغییر بار سطحی آن‌ها از منفی تا مثبت در برابر باسیلوس بررسی کردند. نانوذرات نقره استفاده شده در این پژوهش، شامل نانوذرات بدون پوشش (mV 22 =Z) و پوشش داده شده با سیترات (mV 40 =Z) ، پلی ونیل پایرولیدن (mV 12 =Z) و پلی اتیلن ایمین شاخه‌دار (mV 39+ =Z) بود. داده‌های آزمایشگاهی ارتباط مستقیم میان فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره با بار سطحی را نشان می‌دهد. نانوذراتی که دارای بار منفی بیشتری هستند اثر سمیت کمتری دارند و نانوذرات بار مثبت مؤثرترند. نویسندگان این پدیده را به برهم‌کنش الکترواستاتیکی قوی‌تر بین نانوذرات نقره با بار مثبت و غشا باکتری (باسیلوس در شرایط آزمایش دارای mV 37 =Z است) مرتبط می‌سازند که منجر به تخریب غشا و اثرات ضد باکتریایی قابل توجهی می‌شود (شکل 4 تصاویر TEM برهم‌کنش نانوذرات پوشش داده شده با پلی اتیلن ایمین را با غشا باکتری نشان می‌دهد). افزایش بار سطحی نانوذرات منجر به افزایش برهم‌کنش با غشا باکتری و دوز مؤثر می‌شود.

پژوهش‌های دیگری نیز تأثیر شکل نانوذرات را در اثرات ضد باکتریایی مورد تجزیه و تحلیل قرار داده است. پال[15] و همکارانش نانوذرات کروی، میله‌ای شکل و نانوصفحات مثلثی با صفحه {111} را تولید کردند و ویژگی‌های ضد باکتریایی آن را در محیط مایع و جامد مورد بررسی قرار دادند. نتایج آن‌ها نشان داد که نانوذرات مثلثی بیشترین فعالیت ضد باکتریایی را در برابر سلول‌های ای‌کولای در مقایسه با نانوذرات کروی و میله‌ای شکل و یون‌های نقره نشان می‌دهد. نویسندگان به این نتیجه رسیدند که صفحه {111} فعالیت نقره را در سطح نانومقیاس افزایش می‌دهد. علاوه‌بر این، میکروسکوپ الکترونی فیلتر‌کننده انرژی (EFTE) نیز آسیب قابل توجه به غشا باکتری را نشان می‌دهد که تأییدی بر مطالعات پیشین است. اگرچه نویسندگان نظر قطعی در مورد تأثیر شکل در فعالیت ضد باکتریایی نانوذرات ارائه نکرده‌ند، اما ویژگی ضد باکتریایی نانوصفحات مثلثی شکل را به بار سطحی مثبت آن، که برهم‌کنش‌ با سلول باکتریایی را افزایش می‌دهد، نسبت داده‌اند. درحالی‌که همه این مطالعات سعی بر فهم ارتباط میان ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی نانوذرات نقره با اثرات ضدباکتریایی دارند، لاک[16] و همکارانش سازوکارهای مولکولی فعالیت نانوذرات نقره را با روش پروتئوم با استفاده از ای‌کولای به عنوان سیستم مدل مورد بررسی قرار دادند. در این پژوهش، پروتئوم موازی (الکتروفورز دو بعدی،‌شناسایی MS و آنالیز ایمنوبلات[17]) روی نانوذرات nm9 و یون‌های Ag+ انجام شد، قرارگیری کوتاه‌مدت سلول‌های ای‌کولای در معرض نانوذرات نقره و یون‌های Ag+ تغییراتی را در پیش ماده پروتئینی (مانند OmpA، OmpC، OmpF، OppA، MetQ) که شاهد مستقیمی از نیرو محرکه اتلاف پروتون است، به‌وجود آورد. همچنین پروتئین‌های شوک حرارتی (IbpA، IbpB و 30S ریبوزومی S6) که فعالیت چپرونی در برابر دناتوره شدن پروتئین‌های بیان‌کننده تنش دارند در مورد نانوذرات نقره انکوبه شده متفاوت است. برخی از محققان، در بررسی پروتئوم نشان دادند که نانوذرات نقره قادر به ناپایدار نمودن غشا خارجی باکتری، تخریب پتانسیل غشا و تخلیه سطح درون سلولی ATP است. سازوکار مولکولی فعالیت نانوذرات نقره و یون‌های Ag+ تقریباً با یکدیگر مشابه است. خلاصه‌ای از این نتایج در شکل 5 نشان داده شده است. پژوهشگران بسیاری نیز تلاش کرده‌اند که بتوانند نقش اندازه نانوذرات و سازوکارهای فعالیت را در ویژگی‌های ضدباکتریایی درک کنند. نانوذرات کوچک‌تر، مهار قوی‌تری بر رشد میکروارگانیسم‌ها در مقایسه با ذرات بزرگ‌تر دارند (اگرچه باید توجه نمود که در دوز جرمی یکسان، تعداد نانوذرات نقره کوچک‌تر نسبت به نانوذرات بزرگ‌تر بیشتر است) ، در حالی‌که اثرات ضد باکتریایی عمدتاً سازوکار نسبتاً مشابهی با آسیب غشایی مستقیم، یعنی تولیدROS ناشی از نانوذرات نقره و یون‌های Ag+، دارد. علی‌رغم پژوهش‌های زیاد انجام شده در این راستا، هنوز نگرانی‌هایی در مورد سازوکار سمیت، خصوصاً نقش نانوذرات و یا یون‌های Ag+ آزاد شده از سطح نانوذرات وجود دارد. براساس مطالعات زو و همکارانش، فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات نقره به علت رهایش یون‌های Ag+ از سطح ذرات در محیط است که سهم آن‌ها در سمیت نادیده گرفته می‌شود. در نانوذرات نقره پوشش داده شده با PEG که دارای اندازه 5 و 11 نانومتر بوده و در شرایط غیرهوازی نگهد‌اری شده‌اند از رهایش یون‌ها به شدت جلوگیری شده است.

در واقع انتشار یون‌های Ag+ با قرارگیری نقره در معرض اکسیژن بر طبق روابط زیر حاصل می‌شود:

(1)   2Ag2O à4Ag (0) +O2

(2)   2Ag2O+4H+ à4Ag++2H2O

مولکول‌های اکسیژن سبب تشکیل اکسید نقره می‌شوند که علت اصلی رهایش یون‌های Ag+ از طریق برهم‌کنش با یون‌های H+ است. شرایط اسیدی، رهایش را نسبت به محیط‌هایی با pH خنثی افزایش می‌دهد. علاوه‌براین، محققان از ای‌کولای به عنوان مدل (به دلیل حساسیت آن به یون نقره در شرایط هوازی و غیر هوازی) برای آزمایشات ضد میکروبی استفاده نمودند. تا زمانی‌که غلظت نانوذرات هزار برابر بیشتر از غلظت کشندگی حداقل (MLC) در شرایط هوازی نباشد اثرات قابل توجهی بر میکروارگانیسم ندارند (شکل 6). این نشان می‌دهد که یون‌های نقره رها شده از سطح نانوذرات مسئول فعالیت ضدباکتریایی هستند. پژوهشگران به این نتیجه ‌رسیدند که ویژگی‌های فیزیکی-شیمیایی نانوذرات نقره (اندازه، شکل و بار) به صورت غیر مستقیم، و عمدتاً از طریق عواملی که بر سرعت، موقعیت و مقدار رهایش Ag+ از سطح نانوذرات تأثیر می‌گذارد، در سمیت نقش دارد. به عنوان مثال، نانوذرات نقره بسیار کوچک سمیت بیشتری را ایجاد می‌کنند زیرا به دلیل مساحت سطح بیشتر سرعت رهایش در مقایسه با نانوذرات بزرگ‌تر بیشتر است. این یافته‌ها برخی از جنبه‌های غیر مشخص سمیت باکتریایی نانوذرات نقره را آشکار می‌سازد. با این وجود هنوز موارد نگران‌کننده در زمینه سازوکار آسیب یونی به باکتری، محدودیت‌های آزمایشگاهی و کمبود پروتکل‌های استاندارد برای تولید نانوذرات نقره وجود دارد که در بخش بعدی مورد بررسی قرار می‌گیرد.

 

3-  موارد مورد بحث

با وجود استفاده وسیع از نانوذرات نقره به عنوان عامل ضدباکتریایی در کاربردهای تجاری و بسیاری از مطالعات، هنوز بحث‌های زیادی در این زمینه وجود دارد. در ادامه، به بررسی مشکلات و محدودیت‌های برخی از روش‌ها می‌پردازیم و پیشنهاداتی نیز در این زمینه بیان می‌کنیم. برای طراحی کارآمد دستگاه‌های ضدباکتریایی برپایه نانوذرات نقره نیز راهکارهایی ارائه می‌کنیم و به‌طور خاص در مورد این‌که چه زمان باید از نانوذرات نقره یا یون نقره برای دستیابی به اثرات ضدباکتریایی در اهداف خاص استفاده کرد، بحث خواهیم نمود.

 

3-1- سازوکار فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات نقره

در بخش پیشین اشاره شد که سازوکار اصلی خاصیت ضدباکتریایی نانوذرات نقره، رهایش یون‌های نقره است. درهرحال سازوکار فعالیت یون‌های نقره از دیدگاه میکروبیولوژی مولکولی هنوز به طور کامل شناخته نشده ‌است. برخی سازوکارهای اصلی عبارت است از؛ آسیب به غشا سلولی، تولید گونه‌های فعال اکسیژن و حمله سلولی یون‌های نقره (یا حتی نانوذرات نقره به دلیل وجود حفرات غشائی) و در ادامه آسیب به محصولات ATP و بازدارندگی تکثیر DNA. در پژوهش‌های بسیاری، آسیب به غشا سلولی به‌وسیله‌ی یون‌های نقره گزارش ‌شده است. این گزارش‌ها عمدتاً برپایه مشاهده حفره‌ها یا حتی سوراخ‌های بزرگ در غشا باکتریایی با آنالیز TEM است. ممکن است یون‌های نقره با پروتئین‌های غشایی حاوی سولفور (به عنوان مثال با گروه تیول پروتئین زنجیره تنفسی) برهم‌کنش داده و باعث آسیب فیزیکی به غشا شوند. خصوصاً بخش تیول، براساس تئوری اسید- باز نرم و سخت[18]، یک لیگاند نرم (قطبش پذیر) است، یعنی اندازه بزرگ و پراکندگی الکترونی زیاد دارد و حاوی یک اوربیتال هومو[19] با سطح انرژی بالا است. بنابراین، گروه تیول ممکن است با کاتیون‌های نرم با میل ترکیبی بالا، یعنی کاتیون‌هایی که حاوی یک اوربیتال لومو با سطح انرژی کم[20] هستند، مانند یون نقره، واکنش دهد. به دلیل اندازه بزرگ و بار کم اتم‌های شرکت‌کننده در پیوند، و جدایش کوچک هومو-لومو بین کاتیون و آنیون، پیوند شبه‌کوالانسی در مقایسه با پیوند یونی مطلوب‌تر است. علاوه‌بر پپتیدها و پروتئین‌های غشایی حاوی سولفور، Ag+ ممکن است در پیوند‌های Ag-N و Ag-O به صورت هندسه کوردیناسیون خطی نیز شرکت نماید. چندین حالت دیگر پپتید/آمینواسید – نقره از نظر تئوری و تجربی پیشنهاد شده است که نشان می‌دهد هیستیدین در مقایسه با سیستئین و متیونین (رایج‌ترین ترکیبات قابل پیوند با نقره) میل ترکیبی بیشتری به نقره دارد. در این زمینه، پژوهش جالبی به‌وسیله‌ی میرلو[21] و همکارانش انجام شده است. در بخشی از این پژوهش، پیوند پروتئین پری‌پلاسمیک غنی از هیستیدین با نقره (SiIE) مورد بررسی قرار گرفت و به عنوان عامل مقاومت نقره شناخته شد. بعد از انحلال ساختار کریستالی کمپلکس‌های نقره-هیستیدین (در pHهای مختلف) ، نویسندگان نتیجه گرفتند که حلقه ایمیدازل در زنجیره هیستدین، بخش پیوند دهنده لیگاند با نقره است و اینکه پیوند یون نقره تحت pH خنثی مستحکم‌تر از شرایط اسیدی است (پروتونه شدن حلقه ایمیدازول، یون نقره را از مکان همسایگی جابه‌جا می‌کند). محاسبات بیشتر بر پایه نظریه تابعی چگالی (DFT) ، توسعه یک مدل برای حالت فعالیت SiIE را قادر می‌سازد.

همه این برهم‌کنش‌های پروتئین‌ها و یون نقره می‌تواند با افزایش رهایش لیپوپلی ساکارید (LPS) و پروتئین‌های غشایی، منجر به تغییر در قابلیت نفوذپذیری غشا شود که سبب اتلاف نیرو محرکه پروتونی و کاهش سطوح ATP درون سلولی می‌شود. ممکن است تجمع درون سلولی یون‌های نقره (و مقدار کمی از نانوذرات نقره) نیز رخ دهد. به‌ویژه یون‌های نقره می‌توانند به پروتئین‌های زنجیره تنفسی متصل شده و در ادامه تنفس را از مسیر فسفریلاسیون اکسیداتیو (که انرژی آزاد شده از اکسید شدن مواد مغذی را برای تولید ATP استفاده می‌کند) جدا کند. همچنین، بیان شده است که یون‌های نقره باعث افزایش جهش DNA می‌شود. ارزیابی‌ها بر پایه آنالیزهای ترکیبی طیف سنجی FTIR و الکتروفورز موئینه نشان داده که در حضور یون نقره مکان‌های پیوندی در DNA برای N7 آدنین و N7 گوانین به مقدار بهینه می‌رسد. علاوه‌بر این یون نقره می‌تواند سبب چروکیدگی سیتوپلاسم، پدیده تراکم DNA و باز شدن غشا دیواره سلولی شود. سازوکار دیگر ضدمیکروبی نقره براساس بازدارندگی آنزیم‌های ویژه مخصوصاً تقلید یونی است. در تقلید یونی، یون نقره، باعث جابه‌جایی مس و روی از همسایگی‌اش با آنزیم سوپراکسید دیسماتوز (Cu-Zn SOD) و غیرفعال نمودن آن می‌شود. در این زمینه، بار سطحی نانوذرات نقره می‌تواند بر قابلیت اتصال نانوذرات بر باکتری تأثیرگذار باشد و ممکن است به علت برهم‌کنش الکترواستاتیکی نقش مهمی را ایفا نمد. به عنوان مثال، بار سطحی مثبت نانوذرات ممکن است اتصال آن‌ها را به غشا باکتری افزایش داده و منجر به افزایش دسترسی به دوز مؤثر و افزایش رهایش موضعی یون‌ها شود. در همین زمان، رهایش یون‌های نقره در نزدیکی غشا خارجی باکتری به علت نیروی محرکه پروتونی که کاهش موضعی شدید pH را القاء می‌کند، به شدت افزایش می‌یابد.

درهرحال، این امر به این معنی نیست که نانوذرات با بار مثبت به‌طور کلی در مقابل باکتری‌ها مؤثر‌تر هستند، همان‌طور که بار سطحی واقعی نانوذرات در محیط باکتریایی (مانند تأثیرات پروتئین کرونا) برهم‌کنش باکتری و نانوذره را هدایت می‌کند.

یکی دیگر از سازوکارهای سمیت نقره، مربوط به تولید ROS با یون نقره است. در حقیقت ROS اضافی به علت تولید رادیکال‌های آزاد اضافی که به لیپیدها و DNA آسیب می‌زند، منجر به تنش اکسایشی می‌شود. یون‌های نقره، در ترکیب با مولکول‌های اکسیژن حل نشده، ممکن است به عنوان کاتالیست عمل کرده و سطح بالایی از ROS را تولید کند. علاوه‌براین رادیکال‌های آزاد ممکن است از مضرات مستقیم آنزیم‌های زنجیره تنفسی باشد؛ آن‌ها با نقره یا به‌صورت فوتوکاتالیستی و یا با واکنش‌های فنتون افزایش یافته با نقره القاء می‌شوند. در مورد آخر، یون نقره خوشه‌های پروتئینی (که معمولاً درE.coli در غلظت 20 میکرو مولار به عنوان شکل فعال با فنتون حضور دارد) را مورد هدف قرار داده و آسیب می‌زند و منجر به افزایش رهایش سیتوپلاسمی آهن فعال شده با فنتون و در نتیجه افزایش تولید ROS می‌شود. در بسیاری از پژوهش‌ها تأثیرات ضدباکتریایی هر دو گونه ROS و RSN (گونه‌های نیتروژن فعال) بحث برانگیز باقی‌مانده است. در حقیقت، میکروارگانیسم‌ها چندین راهکار مولکولی برای از بین بردن تنش تولید شده با ROS و RSN دارند. برخی از راهکارها عبارتند از سم‌زدایی مستقیم انجام شده با آنزیم‌هایی مانند کاتالاز، سوپراکسید دیستاماز و پراکسیداز (برای حذف ROS) و رداکتاز NO، رداکتاز S-nitrosogluthathione و رداکتاز پراکسی نیتریت (برای سم زدایی RNS). علاوه‌براین، باکتری به‌صورت فعال به تنش‌های اکسیژنی و نیتروژنی در سطح نسخه‌برداری با تنظیم بیان چندین پروتئین که امکان زنده ماندن باکتری را در برابر چنین تنش‌هایی فراهم می‌سازد، پاسخ می‌دهد. در شکل 7 نمای کلی توصیف‌کننده همه تأثیرات ممکن نانوذرات نقره بر میکروارگانیسم ارائه شده است.

 

3-2- نقش خواص فیزیکی- شیمیایی نانوذرات نقره

تلاش‌های زیادی برای یافتن ارتباط بین خواص فیزیکی- شیمیایی و اثر ضدباکتریایی نانوذرات نقره انجام شده است. درحالی‌که به نظر می‌رسید بار سطحی نقش مهمی را ایفا کند، با ارزیابی داده‌های مربوط به اندازه و شکل نانوذرات موجود در پژوهش‌ها، اختلافات زیادی آشکار شد. این امر عمدتاً به دلیل نبود استانداردهای لازم برای نانوذرات نقره و رویکردها و پروتکل‌های استاندارد در ارزیابی‌های میکروبیولوژی است. برای غلبه بر فرآیندهای تولید و رویکردهای مشخصه‌یابی نانوذرات موارد قابل توجهی انجام شده است. در سال‌های اخیر، تولید نانوذرات با میانگین و توزیع اندازه کنترل شده و بازدهی بالا چالش بزرگی است. در واقع، عوامل مختلف سینتیکی و ترمودینامیکی بر تولید نانوذرات نقره تأثیر می‌گذارد و مشکلات قابل توجهی در کنترل مراحل متمایز هسته‌زایی و رشد ذرات وجود دارد. اخیراً اندک نتایج خوبی حاصل شده است. خصوصاً، مشخص شده است که پپتیدهای خاصی می‌توانند به عنوان کاتالیست و قالب برای تولید سبز نانوذرات نقره (با قابلیت بالای کنترل ابعادی نانوذرات) به‌کار روند. برای مثال در رویکرد جالبی، غربالگری کالریمتری آمینواسیدهای طبیعی و غیرطبیعی برای ارزیابی تشکیل نانوذرات نقره کنترل شده مورد استفاده قرار گرفت (شکل 8، الف، ب). برخلاف برخی رویکردهای ترکیبی پیشین برای تشخیص پپتید مناسب، این غربالگری کالریمتری ارائه دهنده یک ابزار قدرتمند برای تشخیص پپتید مناسب تولید‌کننده نانوذرات نقره با کیفیت بالا و تنظیم‌کننده اندازه آن‌ها است. در پژوهش دیگر، آپرت و همکاران الیگوپروتئینی را برای تولید نانوذرات نقره با اندازه کنترل شده کشف کرند. آن‌ها از طول‌های مختلف الیگروپروتئین عامل‌دار شده با آلدهید با ترکیب واکنش تالنز برای کاهش یون نقره استفاده کردند و دریافتند که ابعاد مولکولی الیگوپروتئین رابطه مستقیم با افزایش اندازه نانوذرات نقره دارد (شکل8، ج، د). در مقایسه با رویکردهای تولیدی استاندارد‌تر، ‌که معمولاً عوامل پایدارکننده؛ پلیمرها، اسید سیتریک، تیروزین و تیول است، هیبرید پپتید-نانوذرات نقره گزینه بهینه‌ای برای کاربرد در حوزه پزشکی، بیوتکنولوژی و دستگاه‌های اپتیکی است.

در هرحال باید به این موضوع توجه کرد که اکثر پژوهش‌ها در زمینه اثرات ضدباکتریایی نانوذرات نقره براساس استفاده از نانوذرات با خواص عمدتاً غیرقابل کنترل است (به عنوان مثال پراکندگی بالا در شکل و اندازه و یا مشکل توده‌ای شدن). علاوه‌براین در بسیاری از پژوهش‌ها، نانوذرات را بدون در نظر گرفتن مشخصه‌های فیزیکی-شیمیایی‌ به‌کار می‌برند که سبب افزایش اختلاف در نتایج می‌شود. بنابراین یک نکته مهم برای ارزیابی استاندارد و قابل تکرار، مشخصه‌یابی نانوذرات قبل از هر نوع ارزیابی ضدباکتریایی است: نانوذرات باید بعد از فرآیند تولید (مثلا در محلول آبی) و مهم‌تر از همه به‌صورت درجا (مثلا بعد از گرماگذاری با محیط کشت باکتریایی) ارزیابی شوند. ارزیابی خواص فیزیکی- شیمیایی نانوذرات در سیالات بیولوژیکی از اهمیت زیادی برخوردار است، زیرا محیط باکتریایی باعث تغییرات چشمگیری در خواص اصلی نانوذرات شده و نانومواد جدیدی با مشخصه‌های کاملاً متفاوت تولید می‌شود. برای مثال، با توجه به اینکه نانوذرات با جذب پروتئین‌های معین و سایر مولکول‌های کوچک روی سطح‌شان می‌توانند اندازه بزرگ‌تر، بار سطحی و پوشش‌دهی متفاوتی را در مقایسه با نانوذرات تولید شده با رویکرد مشابه داشته باشند و همچنین ممکن است به صورت چشمگیری تحت تأثیر پدیده توده‌ای شدن قرار گیرند. در حقیقت اغلب نانوذرات نقره در محیط باکتریایی پایدار نیستند، بنابراین شدیداً اثرات ضدباکتریایی را تحت تأثیر قرار می‌دهند. به‌علاوه، ممکن است همه این عوامل، دینامیک رهایش یون‌ها و دوز مؤثر یون نقره را تحت تأثیر قرار دهد که در نهایت منجر به تکرارناپذیری نتایج می‌شود. نکته مهم دیگر تأثیر سینتیک رهایش یون در حضور باکتری است. معمولاً میکروارگانیسم‌ها pH محیط کشت باکتریایی را کاهش می‌دهند، بنابراین نرخ رهایش یون از سطح نانوذرات افزایش می‌یابد. میزان اسیدیته محیط علاوه‌بر محیط به سویه نیز وابسته است (مثلاً تابعی از الگو متابولیکی باکتریایی و یا حضور مولکول‌های معین در محیط) و ممکن است باعث کاهش چشمگیر pH و تأثیر بر سمیت نانوذرات نقره شود. این امر به‌ این معنی است که نانوذرات نقره یکسان ممکن است تنها به دلیل اسیدیته متفاوت محیط، بازدهی ضدمیکروبی متفاوتی در مقابل دو سویه مختلف داشته باشند. برای مثال باکتری لاکتیک اسید (مانند جنرا لاکتوباسیل، پدیکوکوس، استرپتوکوکوس، لئوکونوستیک و لاکتوکوکوس) ، لاکتیک اسید تولید می‌کند که برای اسیدی کردن محیط و بازدارندگی رشد باکتری‌ها مفید است. اسیدی کردن محیط با سایر باکتری‌ها مانند باکتری اسید استیک (مانند استوباکتر، گلوکواستوباکتر و گلوکونوباکتر) نیز انجام می‌شود. این موارد یک آنزیم متصل شده به غشا، دی‌هیدروژناز الکل وابسته به پیروکویینولین کویینون (PQQ_ADH) ، دارند که در تخمیر اسید استیک با اکسیداسیون اتانول به استیل آلدهید شرکت می‌کنند. دراین چارچوب، مشخصه‌یابی رفتار دقیق انحلال نانوذرات در محیط انجام تست ضدباکتریایی، که مستقیماً در محیط کشت و در حضور سویه خاص باکتریایی انجام می‌شود، ضروری است. عامل دیگری که باعث متغیر شدن تست می‌شود، تنوع زیاد محیط‌های کشت‌ موجود است. اگرچه ترکیبات شیمیایی اصلی آن‌ها کاملاً رایج است، ولی تغییر پذیری و غیریکنواختی زیاد در محیط‌های کشت‌ استفاده شده در تست‌های ضدمیکروبی وجود دارد. بنابراین، تنوع محیط بر ویژگی‌های فیزیکی– شیمیایی نانومواد بسیار تأثیرگذار است. این به این معنی است که اگر تست در دو محیط مختلف انجام شود، نانوذرات نقره یکسان خواص ضدمیکروبی متفاوتی نمایش می‌دهند. همچنین ترکیب محیط بر دوز یون نقره نهایی تأثیر می‌گذارد، زیرا یون‌های آزاد بسته به میل ترکیبی‌شان با پروتئین‌های خاص و نمک‌های موجود به صورت جزئی ربوده خواهند شد. به همین دلیل، به منظور اطمینان از تکرارپذیری نتایج باید رویکرد صحیحی به‌کار گرفته شود. در این رویکرد، نانوذرات باید به‌طور کامل در محیط کشت یکسان مشخصه‌یابی (برحسب پایداری کلوییدی و سینتیک رهایش یون‌های نقره) شود و محیط مورد استفاده به عنوان پارامتر مهم سنجش در نظر گرفته شود.

مورد دیگری که لازم است به آن توجه شود، روش‌های‌شناسایی دینامیک انحلال نانوذرات در محیط‌های رایج است. در این زمینه، چندین رویکرد به منظور مشخصه‌یابی رهایش یون‌های نقره از سطح نانوذرات کشف شده است. رایج‌ترین تکنیک‌هایی که نسبتاً حساس هستند، تکنیک‌های برپایه طیف‌سنجی پلاسمای جفت شده‌ی القایی (یعنی به ترتیب نشر نوری یا طیف سنجی جرمی، ICP-OES و ICP-MS) است. در هرحال، این روش مشکلات اساسی دارد، چون یون‌های نقره پیش از کمی‌سازی ICP باید به ‌صورت فیزیکی از نانوذرات نقره جدا شوند. برای مثال، ممکن است رسوب کامل نانوذرات کوچک با سانتریفوژ امکان‌پذیر نباشد، همچنین آلترافیلتراسیون نیز علاوه‌بر زمان‌بر بودن، باعث جذب یون روی غشا شود (در این مورد، این احتمال وجود دارد که نانوذرات در طول فرآیند طولانی جداسازی، حل شوند). بنابراین، روش‌های جایگزینی مانند آنالیزهای UV-vis پیشنهاد شده است. اخیرًا پژوهش جالبی پیشنهاد می‌کند که اکثر رویکردهای روش‌شناسی در بررسی انحلال نانوذرات نقره (حتی در ماتریس‌های محیطی و زیستی پیچیده) ، مشخصه‌یابی باند جذب پلاسمون سطحی‌شان است. نویسنده بیان می‌کند که برخلاف سایر رویکردها، روش جذبی برای تعیین صحیح مقدار نقره به صورت یون یا نانوذرات دقیق‌ترین رویکرد است، حتی در سیالات محیطی و زیستی که معمولاً حاوی کلرید هستند (که باعث تشکیل رسوبات کلرید نقره می‌شود که با رویکردهای برپایه ICP قابل‌شناسایی نیست). در هرحال اگرچه این روش اجازه می‌دهد که تجزیه نانوذرات نقره را دقیقاً کنترل کنیم (به شرط اینکه نانوذرات پایدار و با توزیع اندازه یکنواخت باقی بمانند) ، ولی با درنظر گرفتن دسترس‌پذیری زیستی واقعی یون نقره اطلاعات قابل اطمینانی را ارائه نمی‌دهد، زیرا یون‌ها با پروتئین‌ها و نمک‌های محیطی واکنش داده و یا تشکیل رسوب می‌دهد. در حقیقت پیک جذب، تشکیل خوشه‌های AgCl و یا کمپلکس‌های پروتئین- نقره، که هر دو دوز مؤثر نهایی یون نقره را کاهش می‌دهند،‌شناسایی نمی‌کند (آنها عوامل اولیه تعیین‌کننده سمیت ضدباکتریایی هستند). بنابراین، برای دستیابی به اطلاعات دقیق درمورد حالت انحلال و دینامیک نانوذرات نقره، باید از ترکیب هردو تکنیک UV-vis و ICP استفاده نمود. همان‌طور که در بالا اشاره شد، در هر مورد باید انحلال نانوذرات نقره در حضور باکتری به دلیل اسیدیته مربوط به میکروارگانیسم در محیط کشت، مشخصه‌یابی شود.

یکی دیگر از جنبه‌های مهمی که باید مورد ارزیابی قرار داد، پایداری کلوییدی نانوذرات نقره در محیط باکتریایی است (در برخی موارد پدیده توده‌ای شدن به دلیل تغییر رنگ سوسپانسیون با چشم نیز قابل‌شناسایی است). یکی از راه حل‌های مناسب برای غلبه بر چنین ناپایداری، غیرفعال‌سازی سطح نانوذرات نقره با عوامل پوشش‌دهنده خاص مانند آلبومین سرم گاوی (BSA) است. مک‌کاسپیه در پژوهشی که با استفاده از تکنیک‌های ابزاری متنوع (شامل میکروسکوپ نیروی اتمی، تفرق نور پویا و طیف سنجی UV-vis) انجام داد، نشان داده است که پوشش‌دهندگی BSA در مقایسه با پایداری الکترواستاتیک تنها، مانند سیترات، پایداری بهتری برای نانوذرات نقره تأمین می‌کند. اگرچه این روش دقیق‌ترین رویکرد برای تست‌های استاندارد است، اما باید به این نکته اشاره نمود که چنین روش‌هایی کاملاً دور از شرایط واقعی هستند (هم درون تنی و هم برون تنی) ، به عنوان مثال ممکن است BSA در شرایط واقعی پدیده ایمنولوژیک را القاء کند. علاوه‌براین، در فرآیند پایدارسازی، به علت پوشش‌دهی سطح نانوذرات با چندین لایه پروتئینی، بار سطحی آن‌ها تغییر کرده و نرخ رهایش یون‌ها به شیوه غیرقابل کنترلی تحت تأثیر قرار می‌گیرد. بنابراین، دستیابی به یک رویکرد معین و قابل اطمینان برای کنترل دقیق پایداری کلوییدی نانوذرات نقره هنوز در حال بررسی و ارزیابی است.

جنبه مهم دیگر به‌وسیله‌ی فصل مشترک‌های ممکن در تست‌های زیستی برای ارزیابی فعالیت ضدمیکروبی ارائه داده می‌شود. یکی از مهم‌ترین روش‌ها، آنالیز طیف سنجی چگالی نوری یا کدروت سنجی سوسپانسیون باکتریایی (معمولاًً در nm 600l=) برای اندازه‌گیری غلظت سلولی است. علی رغم اینکه سهولت استفاده از کدورت سنجی از مزایای این روش است، مشکل این روش، ضریب خاموشی بسیار بزرگ نانوذرات نقره و تداخل آن در جذب نوری نمونه است (مخصوصاً اگر باند پلاسمونی نانوذرات نقره با توده‌ای شدن آنها، شیفت قرمز نماید و با چگالی نوری غلظت باکتریایی هم‌پوشانی داشته باشد). علاوه‌براین، نتایج تست رنگ سنجی و فلورسنس برای تشخیص نسبت سلول‌های زنده به مرده در مجاورت نانوذرات نقره، به دلیل برهم‌کنش نانوذرات نقره با ترکیبات کیت تجاری، غیرواقعی بوده و نتایج منفی یا مثبت نادرستی را ارائه می‌نماید (در حقیقت کیت‌های تجاری برای تست نانوذرات نقره طراحی نشده‌اند). درواقع، برای اجتناب از نتایج غیر واقعی سنجش متابولیکی و قابلیت زنده ماندن سلول، نیاز به آزمایشات دقیق و توجه ویژه‌ای است.

بنابراین، همه موارد اشاره شده در بالا بیانگر نیاز به تست‌هایی با استانداردهای بیشتر است که قابلیت در نظر گرفتن همه‌ی محدودیت‌های موجود در هر تکنیک و روش را داشته باشد. به‌خصوص حالت توده‌ای شدن نانوذرات، نرخ رهایش یون‌ها و تغییر در خواص فیزیکی- شیمیایی در حین گرماگذاری نانوذرات با محیط باکتریایی از پارامترهای مهمی به‌شمار می‌رود که به منظور دستیابی به داده‌های زیستی قابل اطمینان باید مورد ارزیابی قرار گیرد.

 

3-3- نانوذرات یا یون‌های نقره برای دستگاه‌های ضدمیکروبی؟

در بخش قبلی توضیح داده شد که سازوکار فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات نقره عمدتاً به دلیل رهایش یون‌های نقره از سطح است. این بدان مفهوم است که نانوذرات نقره در مقابل میکروارگانیسم‌ها در مقایسه با یون‌های نقره تأثیر کمتری دارند (با دوز نقره یکسان). در واقع در نانوذرات نقره، یون‌های کمتری به صورت آنی برای از بین بردن باکتری‌ها در دسترس است. انحلال فراوان و سریع نانوذرات نقره در زیست‌محیطی برای تولید مقادیر یکسانی از یون‌های آزاد با نمک‌های نقره غیرممکن است. در دوز یکسان از نانوذرات و یون‌های نقره، بازده متفاوتی در مهار رشد سلول ای‌کولای گزارش شده است. همان‌طور که در شکل 9 نشان داده شده است، یون‌های نقره در مقایسه با نانوذرات نقره، با دوز یکسان، تأثیر بیشتری در پیشگیری از رشد باکتری دارند. اطلاعات مختلفی را می‌توان از این داده‌ها استخراج نمود. سمیت بیشتر نیترات نقره به مقدار بیشتر ترکیبات ضدباکتریایی در دسترس در محیط کشت باکتری نسبت داده می‌شود. در حقیقت، نانوذرات نقره به زمان بیشتری برای رهایش یون نقره نیاز دارد و دوز اولیه به‌دست آمده از نانوذرات نقره معمولاً کم است (حداقل در مورد نانوذرات تازه تولید و شستشو شده). نکته حائز اهمیت این است که آزمایشات ضدباکتریایی با نانوذرات نقره باید با سوسپانسیون نانوذرات نقره تازه تولید و شستشو شده انجام شود. لازم است با در نظر گرفتن این نکته که غلظت یون‌های نقره تابعی از عمر نمونه است، از غیرقابل تکرار بودن داده پرهیز شود. همان‌طور که کیتلر و همکارانش گزارش کردند، نانوذرات نقره از پیش سنتز شده در مقایسه با نمونه‌های تازه‌تر در مقابل باکتری مؤثرترند. بنابراین، تغییرپذیری نمونه از یک بچ به بچ دیگر افزایش می‌یابد. نکته مهم دیگر مربوط به طراحی کلی دستگاه ضدباکتریایی مورد استفاده برای نقره یا نانوذرات نقره است. زمانی‌که یک دستگاه با کاربرد ویژه مد نظر است، تأثیر زمانی خاصیت ضدباکتریایی باید در نظر گرفته شود. کاربردهایی که به دوز بالا و آنی ترکیبات ضدباکتریایی نیاز دارد باید با نمک‌های نقره طراحی شود که قادر به مهار رشد سریع میکروارگانیسم‌ها در مراحل اولیه است. در مقابل اگر رهایش کنترل شده و طولانی مدت یون‌های نقره مورد نیاز باشد، نانوذرات نقره گزینه ترجیحی است زیرا با تنظیم سینتیک رهایش یون می‌تواند مهندسی (به‌وسیله عامل‌دار کردن سطحی) شود. در این چارچوب، نانوذرات نقره می‌تواند استخری از یون‌های نقره باشد که به هر قسمت از بدن حتی ارگان‌های درون سلولی نیز رسانش کند، بنابراین مسیری را برای درمان عفونت‌های مزمن مربوط به میکروارگانیسم‌های مقاوم فراهم می‌کند. علاوه‌براین، عملکرد برخی دستگاه‌های پزشکی ویژه مانند دستگاه‌های مربوط به کاشت، با ترکیب با دو شکل نقره، یون‌ها و نانوذرات، بهبود پیدا می‌کند. مزایای این ابزارهای ترکیبی عبارتند از 1- منبع آنی یون نقره که ممکن است مانع چسبندگی و کلونی شدن باکتری شود. بنابراین، از تشکیل و توسعه عفونت‌های باکتریایی شدید پیشگیری می‌کند. 2- رسانش قابل کنترل و طولانی مدت مقدار کمی از یون نقره از نانوذرات نقره. همچنین شایان ذکر است که نانوذرات نقره به دلیل برخی مشخصات ذاتی مثبت، در مقایسه با یون‌های نقره، گزینه مناسبی برای توسعه داروهای ضدباکتریایی جدید هستند. در حقیقت نانوذرات نقره رفتار اسب تروجان دارند یعنی در مقایسه با یون‌ها/نمک‌ها بیشتر به درون سلول‌ها و ارگانیسم‌ها وارد می‌شوند. از مزایای دیگر این ذرات، هدفمند نمودن سلولی دقیق‌تر با عامل‌دار کردن سطح است. علاوه‌براین، برخلاف تست‌های کلاسیک که در محلول انجام می‌شود (یعنی تست مدل) ، در شرایط واقعی (آزمایشات درون تنی) نانوذرات در مقایسه با یون‌های نقره، دوز مؤثر بیشتری را تولید می‌کنند.

 

3-4- مقاومت باکتریایی به نقره: یک موضوع نگران‌کننده جدید

همان‌طور که در مقدمه توضیح داده شد، استفاده بی‌رویه از آنتی‌بیوتیک‌ها در دهه‌های اخیر باعث افزایش شدید گونه‌های باکتری مقاوم به آنتی‌بیوتیک شده است. همچنین، به دلیل استفاده فزآینده از نقره یا نانونقره در ابزارهای پزشکی و تجاری، باکتری‌ها در حال توسعه راهکارهای مولکولی برای مقابله با این مواد هستند. معمولاً سازوکار مقاومت باکتریایی به مواد سمی به‌وسیله‌ی توالی خاصی از DNA که در مواد ژنتیکی غیرکروموزمی با نام پلاسمید حضور دارند، کدگذاری می‌شود. به‌طور شگفت‌انگیزی میکروبیولوژیست‌ها دریافتند که برخی از سویه‌های ای‌کولای، یک خوشه ژنی کروموزمی خاص با نام سیل را نمایش می‌دهند که برای چندین پروتئین مسئول مقاومت در مقابل فلزات سنگین و به‌ویژه نقره کدگذاری شده است. خوشه سیل شامل 9 ژن کدگذاری برای دو پروتئین سیستم افلاکس، SilCBA و SilP است که فعالیت مولکولی‌ آن با دو پروتئین پری‌پلاسمیک پیوند دهنده با نقره، SilE و SilF، ترکیب می‌شود. کمپلکس پروتئینی SilCBA (شامل غشا خارجی SilC، غشا داخلی SilA و SilB که SilC و SilC را به هم متصل می‌کند) به عنوان یک ضدباربر عمل می‌کند، در واقع یون‌های نقره را از سیتوپلاسم به خارج سلول و H+ را از خارج سلول به داخل پمپ می‌کند. در همین زمان، پروتئین‌های SilC، یون‌های نقره را مستقیماً به فضای پری‌پلاسمیک انتقال می‌دهند و بنابراین به عنوان یک ATPase نوع P عمل می‌کنند. در اینجا پروتئین‌های پیوند دهنده با نقره SilE و SilF (یک نوع نگهبان مولکولی) با یون‌های نقره کمپلکس شده و آن‌ها را به کمپلکس SilCBA انتقال داده و فرآیند تخلیه ادامه پیدا می‌کند. باید توجه کرد که این سازوکار‌های مقاومت مربوط به فعالیت یون‌های نقره درون سلولی است درحالی‌که آن‌ها نمی‌توانند از آسیب مستقیم غشا سلولی با یون نقره پیشگیری و یا آن را ترمیم کنند. از طرف دیگر، مدارک تجربی تأکید می‌کند که مقاومت باکتریایی و حساسیت به نقره به شدت بستگی به دسترس‌پذیری زیستی یون نقره دارد. بنابراین ممکن است تغییرات در شرایط محیطی، دسترس‌پذیری زیستی یون‌ها و به‌دنبال آن مقاومت یا حساسیت باکتری را تغییر دهد. گوپتا[22] و همکارانش نشان دادند که یون‌های هالید ید، برم و کلر ممکن است با یون نقره در شرایط متفاوتی کمپلکس شوند و در هر دو محیط کشت جامد و مایع، بسته به غلظت هالیدها، منجر به تشکیل نمک‌های نقره (به شکل رسوب یا خوشه) یا کمپلکس‌های محلول آبی یونی شوند. بنابراین، وقتی محصول عمده کلرید نقره غیرقابل انحلال در آب است، کاهش کلی در دسترس‌پذیری زیستی یون‌های نقره آزاد ایجاد خواهد شد که منجر به افزایش مقاومت نقره می‌گردد. از سوی دیگر وقتی محیط کشت حاوی مقادیر زیادی ترکیبات هالیدی باشد، کمپلکس‌های محلول آبی مختلفی مانند AgX2- و AgX22- را تشکیل می‌دهد. در ادامه، ممکن است کمپلکس‌های یونی هالید-نقره محلول در آب، دسترسی به غشا سلولی را بهبود و دسترس‌پذیری زیستی یون نقره را افزایش دهد که در نهایت منجر به افزایش حساسیت هردو گونه باکتری حساس و مقاوم به نقره می‌شود. بنابراین، در هر رویکرد تولیدی باید به امکان اتصال شیمیایی نانوذرات نقره با مهار کننده‌های مولکولی خاص پروتئین‌های پمپ‌کننده یون نقره توجه کرد. مشابه راهبردهایی که برای برخی عوامل ضدباکتریایی تجاری توسعه پیدا کرده است، به عنوان مثال فعالیت ترکیبی آموکسی‌سیلین (آنتی‌بیوتیک بتا لاکتام) و کلاولانیک اسید (بازدارنده بتا لاکتام باکتریایی که هسته بتا لاکتام تجزیه می‌کند).

علاوه‌براین، شایان ذکر است که پدیده مقاومت نقره ممکن است از انتروباکتریاسه (اولین میکروارگانیسم‌هایی که به نقره مقاومت نشان دادند) به سایر ترکیبات خطرناک (مانند نیسریاسه یا استافیلوکوکوس) تبدیل شود. چنین دیدگاهی می‌تواند یک نگرانی جدی همه‌گیر را مخصوصاً برای بستری نمودن بیماران (جایی‌که که عوامل بیماری‌زای فرصت‌طلب مربوط به عفونت‌ها یکی از اولین عوامل مرگ هستند) به همراه داشته باشد.

 

3-5- مسائل مرتبط با انسان و محیط

همان‌طور که در بخش مقدمه بیان شد، محصولات نانونقره کل جهان، برای کاربردهای تجاری، حدوداً 320 تن در سال است. همچنین، رهایش نقره در محیط در حال افزایش است و تخمین زده می‌شود که به 20 تن در سال برسد. با این وجود، نظرات متفاوتی در ارتباط با خطرات بالقوه رهایش یون نقره گزارش شده است. برای مثال، تحقیقات اکوتوکسیکوژنومیک[23] بر نماتد سینورابدیتیس الگانس[24] نشان دهنده سمیت شدید نانوذرات نقره با رهایش آن در محیط است. در این پژوهش گزارش شده است که نانوذرات نقره به‌طور محسوسی قابلیت تکثیر سی. الگانس را کاهش و بیان سوپراکسید دیسموتاز-3 (Sod-3) ، عامل ایجاد‌کننده تنش اکسیدی، را افزایش می‌دهند. نتایج مشابهی در سایر ارگانیسم‌ها مانند جلبک سبز کلامیدوموناس رینهاردتی[25] یا مدل ماهی زبرا[26]مشاهده شده است. درهرحال این سوال که آیا یون‌های نقره یا نانوذرات نقره نگرانی جدی برای شرایط اقلیمی (مانند جلبک، گیاه یا قارچ) ایجاد می‌کنند، هنوز مطرح است. در حقیقت، تحقیقات اکوتوکسیتی معمولاً در شرایط آزمایشگاهی انجام می‌شود که کاملاً دور از شرایط واقعی (جایی‌که خواص فیزیکوشیمیایی مواد برپایه نقره هنوز غیرقابل پیش‌بینی است) است. برای مثال باید به این نکته توجه کرد که مشخصه سطحی و پراکندگی نانوذرات نقره بر رهایش آن‌ها در ماتریس محیطی تأثیرگذار است و ممکن است پس از پراکندگی آن‌ها در دریا، رودخانه و یا خاک تغییر شکل داده و به صورت کلرید نقره یا سولفید نقره رسوب کند. بنابراین، ارزیابی اکوتوکسیلوژی (بوم سم‌شناسی) تأثیر نانونقره، ممکن است به دلیل تغییر ذاتی مواد هنگام رهایش در محیط، بسیار دشوار باشد. علاوه‌براین، افزایش غلظت نقره به عنوان آلودگی محیطی، احتمال در معرض قرار گرفتن انسان‌ها را از طریق پوستی و استنشاقی افزایش می‌دهد. به‌همین دلیل ارزیابی سمیت نانوذرات نقره توجه زیادی را به خود جلب کرده است. با این وجود داده‌های موجود نمی‌تواند منجر به تصمیم‌گیری مشخصی در مورد سم‌شناسی نانوذرات نقره و سازوکارهای مولکولی شود، زیرا آزمایشات موجود محدودیت‌هایی مانند قابلیت تغییر پذیری داده یا غیرقابل تکرار بودن آن‌ها، کمبود مواد مرجع نانوذرات و پروتکل‌ها و سنجش‌های استاندارد (مانند رویکردهای عملیاتی استاندارد، SOPs برای مشخصه‌یابی نانوذرات و پراکندگی آن‌ها در زیست‌محیطی برای تست‌های برون‌تنی) دارند. این عوامل سبب می‌شود که نتوان به ارزیابی جامعی از خطرات دست یافت. همچنین، مشکلات نظارتی مهمی نیز وجود دارد، به عنوان مثال در اواخر 2011 کمیته اروپایی از SCENIHR (کمیته علمی خطرات بهداشتی نوظهور و تازه‌‌شناسایی شده) درخواست کرد که گزارش قطعی درباره سمیت نانوذرات نقره ارائه شود، با وجود این‌که برخی محققان به‌جای تحقیق و آنالیزهای بیشتر، به شدت خواستار اقدامات نظارتی به‌وسیله‌ی EU بودند. در این چارچوب ذکر این نکته حائز اهمیت است که برخی چالش‌های موجود در ارائه یک تعریف درست از نانوذرات به‌وسیله‌ی نهادهای نظارتی ناشی می‌شود که یک بعد اساسی است و باید در تلاش‌های پژوهشی آینده در نظر گرفته شود. کشف نانومواد استاندارد و سنجش محوری آن‌ها برای یافتن ارتباط درست بین خواص فیزیکوشیمیایی نانوذرات و خروجی‌های زیستی و متعاقباً اثرات جانبی آن است.

 

4-   نتیجه‌گیری

نتایج اثرات ضدباکتریایی نانوذرات نقره، قطعاً به کاربرد بیشتر آن‌ها به عنوان گروه جدیدی از عوامل ضدباکتریایی منجر می‌شود. داده‌های موجود نشان می‌دهد که نانونقره در مقابل طیف وسیعی از باکتری‌ها فعالیت کشندگی دارد و در نتیجه فرصت مناسبی را برای صنایع داروسازی و نانو فراهم می‌کند. خواص کشندگی زیستی نانوذرات نقره به شدت به خواص فیزیکی – شیمیایی مانند اندازه، شکل و بار سطحی وابسته است. با این وجود، نتایج اخیر نشان می‌دهد که مهم‌ترین عامل، قابلیت رهایش یون‌های نقره به‌وسیله‌ی نانوذرات است که تصور می‌شود عامل اصلی سمیت باکتریایی باشد. مهندسی نمودن نانوذرات نقره به منظور تنظیم پدیده رهایش یون نقره، علاوه‌بر کنترل فرآیند رسانش، مسیری قدرتمند را برای ساخت داروهای ضدباکتریایی جدید و نانوکامپوزیت‌های هیبریدی فراهم می‌سازد. از سوی دیگر، هنوز مشکلات متعددی وجود دارد و تلاش زیادی باید در جهت تعیین رویکرد مواد استاندارد و درک جامع از چگونگی برهم‌کنش نانوذرات نقره با باکتری در سطح مولکولی متمرکز شود. علاوه‌بر نکات ذکر شده در بالا، باید به این مطلب اشاره کرد که ممکن است نانونقره به عنوان منبع سمی برای بشر و محیط باشد و لازم است نظارت ویژه نانو، کنترل‌های زیست‌محیطی و بالینی توسعه یابد. همچنین باید به مقاومت باکتریایی نقره نیز توجه زیادی نمود.

 

منبع:

Loris Rizzello , Pier Paolo Pompa "Nanosilver-based antibacterial drugs and devices: Mechanisms, methodological drawbacks, and guidelines", Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 150.